滇重樓 Paris polyphylla Sm. var. yunnanensis (Fr.) H. M. 為百合科重樓屬 Paris L. 植物，主要分布于貴 州、云南和四川等地區(qū)，是《中國(guó)藥典》2015 年版收 載的重樓藥材的基原植物之一，其干燥根莖入藥，具 有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效，是“云 南白藥”“宮血寧膠囊”等多種中成藥的主要原料， 市場(chǎng)需求量較大。市場(chǎng)上的重樓藥材多年以來(lái)主要依 賴于野生采挖，導(dǎo)致野生滇重樓藥材幾近枯竭，尋 求合適的栽培馴化滇重樓的方式迫在眉睫。

1 材料與試劑

2012 年 10 月，滇重樓 2 年生育苗的鮮種采自 云南省大理州農(nóng)業(yè)科學(xué)院種植基地；2013 年 10 月， 滇重樓 1 年生實(shí)生苗和育苗栽培種源的鮮種采自貴 州省種植基地，滇重樓育苗野生種源的鮮種采自貴 州省野生環(huán)境，常溫下河沙貯存 4 個(gè)月，并經(jīng)三峽 庫(kù)區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn) 室（重慶三峽學(xué)院）周濃教授鑒定為百合科植物滇 重樓 Paris polyphylla Sm. var. yunnanensis (Fr.) H. M. 的成熟種子，種子采用單株保存、保證種質(zhì)資 源的穩(wěn)定性和均一性。

1.1 AM 真菌

通過(guò)美國(guó)國(guó)際叢枝菌根真菌種質(zhì)資源保藏中心 購(gòu)得相應(yīng)的 AM 真菌純凈菌劑，其菌劑由三峽庫(kù)區(qū)道 地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室（重慶三 峽學(xué)院）進(jìn)行擴(kuò)增繁殖、儲(chǔ)存保管。接種菌劑為帶有 孢子、菌絲及侵染后根段的栽培基質(zhì)，見(jiàn)表 1。

1.2 試藥

對(duì)照品重樓皂苷 I（批號(hào) 111590-201103）、重 樓皂苷 II（批號(hào) 111591-201103）、重樓皂苷 VI（批 號(hào) 111592-201103 ）、 重 樓 皂 苷 VII （批號(hào) 111593-200402）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，質(zhì) 量分?jǐn)?shù)均大于 98%。乙腈（德國(guó)默克公司，色譜純）， 水（娃哈哈純凈水）。

1.3 儀器

DZF-6050MBE 型電熱恒溫真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；CP225D 型分析天平（德國(guó) Sartorius 公司）；TDZ5-WS 型多管架自動(dòng)平衡離心 機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）； SB-5200DTN 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技 股份有限公司）；LC-20A 型高效液相色譜儀、 UV2450 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津集團(tuán)）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

種子前處理，去除外果皮，用蒸餾水洗凈，10% NaClO 溶液浸泡 15 min 后用蒸餾水洗凈，備用； 紫云英種子用 10% NaClO 溶液浸泡 15 min 后用蒸 餾水洗凈，備用。育苗栽培基質(zhì)為菜園土與河沙的 混合物（體積比 3∶1，過(guò) 2 mm 篩，121 ℃高壓 滅菌鍋內(nèi)滅菌 2 h）。2013 年 1 月、2014 年 1 月分 別將滇重樓 2 年生、1 年生實(shí)生苗育苗，采用室內(nèi) 常溫栽培法，設(shè)置 9 個(gè)處理組（AM 真菌組，S1～ S9）和 1 個(gè)對(duì)照組（CK 組，S10）共 10 組，每組 重復(fù) 10 次，每盆接種 180 個(gè)孢子的混合菌劑（均 分），與紫云英混合播種培養(yǎng)，待滇重樓種子出土 后除去紫云英植株，每盆間苗 20 株。滇重樓栽培 種源及野生種源新鮮種子于 2014 年 01 月與 AM 真菌混合共生育苗，采用室內(nèi)常溫栽培方法，設(shè)置 9 個(gè)處理組（AM 真菌組，S1～S9）和 1 個(gè)對(duì)照組 （CK 組，S10）共 10 組，每組重復(fù) 10 次，每盆接 種 180 個(gè)孢子的混合菌劑（均分），與紫云英混合 播種培養(yǎng)，待滇重樓種子出土后除去紫云英植株， 每盆間苗 20 株。滇重樓幼苗生長(zhǎng)期間定期澆 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液。 于 2015 年 6 月，采集栽培種源滇重樓育苗（T1） 和 1 年生滇重樓實(shí)生苗（T5）待測(cè)滇重樓樣品，于 2015 年 7 月，采集 1 年生滇重樓實(shí)生苗（T6）待測(cè) 滇重樓樣品，于 2015 年 8 月，采集栽培種源滇重樓 育苗家種（T2）、野生種源滇重樓育苗野生（T4）、1 年生滇重樓實(shí)生苗（T7）和 2 年生滇重樓實(shí)生苗（T8）待測(cè)滇重樓樣品，于 2016 年 8 月，采集種子栽培種 源滇重樓育苗（T3）待測(cè)滇重樓樣品。收獲滇重樓的 根莖、根系，洗凈后置于 35 ℃烘箱烘干，用于品質(zhì) 分析；在冰水浴中洗凈根系，剪成 1.0～1.5 cm 長(zhǎng)的 根段，一部分置于福爾馬林-醋酸-70％乙醇（FAA） 固定液中固定后用于菌根侵染率的測(cè)定。

2.2 AM 真菌的侵染率

隨機(jī)選取浸泡于 FAA 固定液中滇重樓根系 30 條，采用 Philips 等的方法染色、制片、鏡檢，根 據(jù) Trouvelot 等的方法統(tǒng)計(jì)菌根侵染率。

2.3 滇重樓幼苗葉片光合色素含量及生理指標(biāo)的測(cè)定

根據(jù)張志良等的方法對(duì)滇重樓幼苗光合色 素含量測(cè)定；過(guò)氧化氫酶（CAT）活性采用紫外分 光光度法測(cè)定；過(guò)氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng) 木酚顯色法測(cè)定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采 用氮藍(lán)四唑法測(cè)定；丙二醛（MDA）和可溶性糖含 量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定；可溶性蛋白含量采用 考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定。

2.4 滇重樓幼苗生物量的測(cè)定

采收滇重樓后，測(cè)定各處理組新鮮根莖質(zhì)量 后，分別置于 35 ℃烘箱中干燥至恒定質(zhì)量，測(cè)定 不同處理組干質(zhì)量，計(jì)算其折干率。

2.5 不同接種時(shí)期滇重樓幼苗根莖中重樓皂苷含量測(cè)定

采用《中國(guó)藥典》2015 年版重樓藥材項(xiàng)下測(cè)定 4 種重樓皂苷的含量。

2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2003軟件作圖，運(yùn)用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與分析

不同接種時(shí)期滇重樓幼苗根系均 在一定程度上受到了 AM 真菌的侵染，除 CK 組未 被侵染外，其他處理組的侵染率在 91.29%～ 100.00%，各實(shí)驗(yàn)組均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）， 這與周濃等的研究結(jié)果一致。而在自然條件下， AM 真菌的侵染率為 36.41%～83.7%。綜上可知， 接種外源AM 真菌對(duì)滇重樓根系菌根侵染率具有一 定的促進(jìn)作用，說(shuō)明通過(guò)外源接種 AM 真菌以提高 滇重樓的品質(zhì)具有可行性。與 CK 組相比，不同接種時(shí)期滇重樓 3 種保護(hù)酶 CAT、POD 和 SOD 的活性有不同 程度的提高。其中，T1、T5 時(shí)期的 POD 與 SOD 活 性提高更為顯著。在不同的處理組中，S6、S8、S9 的 3 種酶活性提高更為明顯。3 種保護(hù)酶的活性表 現(xiàn)為 POD＞SOD＞CAT，可能是因?yàn)?POD 活性對(duì) 環(huán)境變化表現(xiàn)的更為敏感。表明接種 AM 真菌有利 于滇重樓葉片保護(hù)酶活性提高。

4 討論

研究結(jié)果表明，各處理組均能與 AM 真菌形成 一定的共生關(guān)系，但各處理組對(duì)滇重樓生長(zhǎng)發(fā)育情 況的影響程度存在差異。與 CK 組相比，菌根化滇重樓的侵染率良好，即 AM 真菌與滇重樓幼苗 根莖形成了菌根，說(shuō)明通過(guò)引入外源叢枝菌根真菌 可提高滇重樓幼苗的生活力。接種 AM 真菌有助 于光合色素含量的提高，進(jìn)而促進(jìn)滇重樓的生長(zhǎng)發(fā) 育。現(xiàn)有研究表明，AM 真菌能激活植物對(duì)多種生 物或非生物脅迫的防御機(jī)制，從而提高植物的抗逆 性，包括對(duì)病蟲(chóng)害、重金屬污染、鹽害、干旱等脅 迫的抗性。CAT、POD 和 SOD 作為植物體內(nèi)清 除自由基的關(guān)鍵保護(hù)酶，能起到清除活性氧、維持 氧代謝平衡的重要作用。與 CK 組相比，不同接 種時(shí)期滇重樓的 3 種保護(hù)酶活性均大于對(duì)照組，說(shuō) 明接種 AM 真菌增強(qiáng)了植株對(duì)不利環(huán)境的抗性。 植株體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)包括可溶性糖、可溶性蛋 白，其能幫助維系植物細(xì)胞內(nèi)的膨壓進(jìn)而利于增強(qiáng) 植株的抗逆性。與對(duì)照組相比，滇重樓葉片的可溶 性糖的含量均有明顯的增加，但可溶性蛋白變化不 明顯。細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷是植物水分脅迫的重要原 因，葉片中 MDA 含量的增多與膜相對(duì)透性呈顯著 正相關(guān)。各接種時(shí)期的 MDA 含量均低于對(duì)照 組，表明接種 AM 真菌的各處理組降低了受逆境 環(huán)境的脅迫程度。