大腸埃希氏菌（Escherichia coli）通常稱大腸桿菌，在 一定條件下可以引起人和多種動(dòng)物發(fā)生胃腸道感染或尿 道等多種局部組織器官感染，是人體內(nèi)較為常見的食源性 致病菌。近年來，因大腸桿菌污染水或食物造成人類食物 中毒的例子日益增多，該污染物給飲用水水質(zhì)帶來了極大 的安全隱患。中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《生活飲用水水質(zhì) 衛(wèi)生規(guī)范》規(guī)定，總大腸菌群及糞大腸菌群每 100mL 水樣 中不得檢出。因此，實(shí)現(xiàn)水質(zhì)大腸桿菌的快速檢測顯得尤 為重要。

1 材料與方法 

1.1 材料 

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

 大腸桿菌 E. coli BL21、E. coli TG1 均由本實(shí)驗(yàn)室保 存并提供。 

1.1.2 試劑

 pTA2 載體購自上海捷瑞生物公司，基因組提取試劑 盒、割膠回收試劑盒、質(zhì)粒 DNA 小量提取試劑盒等均為上 海莊盟生物科技有限公司的產(chǎn)品。NaCl 為無錫市東昌化學(xué) 試劑有限公司產(chǎn)品，瓊脂粉、瓊脂糖、蛋白胨、酵母提取物 等化學(xué)試劑均購于上海澤衡生物技術(shù)有限公司。10×PCR buffer，MgSO（4 50mmol/L），dNTPS（2.0mmol/L），Taq 酶，50% DMSO，2×SYBR premix Ex-Taq 等均購于 TOYOBO 公司。 uida 基因片段相關(guān)引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司 合成。 

1.1.3 儀器

 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國西格瑪有限公司，Sigma 3K-15）；水平電泳系統(tǒng)（北京市六一儀器廠，DYCP-31D）；恒溫培養(yǎng)箱（太倉精宏儀器設(shè)備有限公司，JINGHONG）；恒 溫?fù)u床（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，DSHZ-300A）；電泳成像 系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，Tanon-2500）；超凈臺(tái)（蘇州 凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-IF）；水浴鍋（太倉精宏儀器有 限公司，JINGHONG）；熒光定量 PCR 儀（德國耶拿分析儀 器股份公司，MiniOpticon）；紫外-可見分光光度計(jì)（上海滬 粵明科學(xué)儀器有限公司，TU-1900）；圖像分析系統(tǒng)（Tanon， Image master VDS）。 

1.2 方法 

1.2.1 大腸桿菌 E.coli BL21 菌基因組提取

 BL21 菌液培養(yǎng)至測到菌液吸光值為 OD=0.2-0.6 時(shí)， 根據(jù)上海莊盟生物科技有限公司基因組提取試劑盒說明 書對(duì) BL21 菌進(jìn)行總 DNA 的提取。質(zhì)粒 DNA 提取方法參 考小量質(zhì)粒抽提試劑盒內(nèi)說明書。提取后的質(zhì)粒 DNA 用 紫外分光光度計(jì)測定其 OD260/OD280 的數(shù)值。 

1.2.2 PCR 擴(kuò)增大腸桿菌 uida 保守基因片段

 通過 GenBank 查找 uida 基因序列，通過 BLAST 比對(duì) 篩選出更為保守的基因片段約為 800bp，設(shè)計(jì)兩對(duì) PCR 引 物（如表 1 所示），采用表 1 中的 uida-F/uida-R 引物，以大 腸桿菌基因組為模板，對(duì)大腸桿菌 uida 保守基因片段進(jìn)行 常規(guī) PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系共計(jì) 50μL，ddH2O 37.5μL，基因 組模板 1μL，10×PCR buffer 5μL，2mM dNTP 4μL，Taq 酶 （5U/μL） 0.5μL，上下游引物各 1μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序如下： 94℃預(yù)變性 3min，94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1min，30 個(gè)循 環(huán)進(jìn)行延伸；4℃保溫 10min。反應(yīng)結(jié)束后，取 5μLPCR 產(chǎn)物 進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳，再由割膠回收試劑盒割膠回收， -20℃保存。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒構(gòu)建

 將上述克隆的 uida 基因片段通過 TA 克隆方法與 pTA2 載體連接，反應(yīng)體系如下：目的基因 7μL，pTA2 載體 1μL，T4 連接酶 1μL，T4 連接酶 buffer 1μL。16℃水浴連接 16h 后，將 uida 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 TG1 菌感受態(tài)細(xì)胞中，均 勻涂布到含氨芐的 LB 平板中，37℃培養(yǎng) 12-16h。挑取單菌 落培養(yǎng)過液后進(jìn)行測序。抽提質(zhì)粒進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電 泳鑒定，所獲得的重組質(zhì)粒命名為 pTA2-uida。 

1.2.4 熒光定量 PCR 條件優(yōu)化

熒光定量 PCR 引物采用表 1 中的 quida-F1/quida-R1 的引物，通過優(yōu)化熒光定量 PCR 反應(yīng)體中退火溫度，退火 溫度選擇在 55~65℃范圍內(nèi)，以 1℃作為梯度進(jìn)行優(yōu)化。最 佳條件根據(jù)擴(kuò)增曲線的 Ct 值和熔解曲線來判斷。

2 結(jié)果與分析

選取 5 個(gè)梯度（103 ~107 copies/μL）的標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒，進(jìn) 行熒光定量 PCR 檢測，曲線呈現(xiàn) S 型，表明 Ct 值與濃度存在良好的線性關(guān)系。由此，以模板濃度對(duì)數(shù) 值為縱坐標(biāo)，Ct 值為橫坐標(biāo)建立熒光定量 PCR 檢測 E.coli 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線回歸的標(biāo)準(zhǔn)方程為：Y=- 0.3823X+12.172（直線斜率 A=-0.3823，截距 B=12.172，X= 模板濃度，單位為 copies/μL），且曲線的相關(guān)系數(shù) R2 >0.98， 說明可信度較高。重復(fù)性測定 107 copies/μL、105 copies/μL、 103 copies/μL 高中低三個(gè)梯度質(zhì)粒模板 Ct 值，計(jì)算平均值和變異系數(shù)。 可知，隨濃度降低，擴(kuò)增曲線的標(biāo)準(zhǔn)差逐漸 增大，變異系數(shù)則始終小于 1%，則說明在合 理的誤差范圍內(nèi)，建立的水質(zhì)熒光定量 PCR 方法重復(fù)性好。

3 討論 

大腸桿菌作為糞源性污染衛(wèi)生細(xì)菌學(xué) 指標(biāo)，在環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測中起著非常重要的指 示作用。若水體中檢測出大腸桿菌則意味著 水質(zhì)已被污染。分布在自然界的大腸桿菌 大多數(shù)是不致病的，主要附生在人或動(dòng)物的 腸道里，為正常菌群，但少數(shù)的大腸桿菌具 有毒性，侵入人體時(shí)，可引起感染，如腹膜 炎、膽囊炎、膀胱炎及腹瀉等。對(duì)老人及小 孩的感染可能是致命性的。因此，我國在飲 用水方面的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)限定 100ml 水樣中不 得檢測出大腸桿菌，該標(biāo)準(zhǔn)要求必須達(dá)到檢 出單個(gè)細(xì)菌的水平。

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