耐熱大腸菌群是在 44. 5 ℃ 仍能正常生長(zhǎng)并發(fā) 酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的大腸菌群，主要來(lái)自糞便，是當(dāng)前 國(guó)內(nèi)外環(huán)境監(jiān)測(cè)部門評(píng)價(jià)水體污染程度的重要監(jiān)測(cè)項(xiàng)目之一，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。因此，選擇 精確、快速、可靠的耐熱大腸菌群檢測(cè)方法，準(zhǔn)確及 時(shí)地監(jiān)測(cè)水體受糞便污染的狀況，對(duì)預(yù)防和控制流 行疾病的發(fā)生與傳播有科學(xué)意義。

1 材料與方法

1．1 水樣

選取廣州市主要水源地及水源調(diào)查點(diǎn)采集的 51 份水樣，按照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 水樣的 采集與保存》( GB /T 5750. 2—2006) 的規(guī)定采集，并 于 0～4 ℃低溫避光保存，4 h 內(nèi)進(jìn)行分析。

1．2 材料和儀器

質(zhì)控樣品( IDEXX) : 貨號(hào) MIC-QC6#D0 718 M; 乳糖蛋白胨培養(yǎng)液( HKM) ; EC 肉湯( HKM) ; 伊紅 美藍(lán) 瓊 脂 培 養(yǎng) 基 ( HKM ) ; MMO-MUG 培 養(yǎng) 基 ( IDEXX) ; 97 孔無(wú)菌定量盤( IDEXX) ; 100 mL 無(wú)菌采樣瓶 ( IDEXX) ; 定量封口機(jī) ( IDEXX) ，( 44. 5 ± 0. 5) ℃恒溫培養(yǎng)箱( BINDEＲ) ，( 36±1) ℃ 恒溫培養(yǎng) 箱( BINDEＲ) ，立式壓力蒸汽滅菌器( 上海博迅YXQ-75SII立式壓力蒸汽滅菌器（非醫(yī)用）) 。

1．3 方法

1．3．1 多管發(fā)酵法

參照《生 活 飲 用 水 標(biāo) 準(zhǔn) 檢 驗(yàn) 方 法》( GB /T 5750. 12—2006) 中 3. 1 節(jié)。
( 1) 初發(fā)酵試驗(yàn): 取 10 mL 水樣接種到 10 mL 雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，取 1 mL 水樣接種到 10 mL 單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，另取 1 mL 水樣注入 9 mL 生理鹽水中，混勻后吸取 1 mL 接種到 10 mL 單料 乳 糖 蛋 白 胨 培 養(yǎng) 液 中。 將 接 種 管 置 于 ( 36±1) ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)( 24±2) h，產(chǎn)酸和產(chǎn)氣的發(fā)酵 管表明試驗(yàn)陽(yáng)性。
( 2) 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn): 輕微振蕩初發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié) 果的發(fā)酵管，用滅菌棒將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到 EC 培養(yǎng)液 中，在( 44. 5±0. 5) ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)( 24±2) h。如所有 管均不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為陰性; 如有產(chǎn)氣者，則轉(zhuǎn)種 于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置( 44. 5±0. 5) ℃ 培養(yǎng)18～ 24 h，凡平板上有典型菌落者，則證實(shí)為耐熱大腸菌 群陽(yáng)性。
( 3) 計(jì)算和報(bào)告結(jié)果: 根據(jù)不同接種量發(fā)酵管 所表現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的數(shù)目，查最可能數(shù) ( MPN) 檢索 表，報(bào)告每 100 mL 水樣中的耐熱大腸菌群最可能數(shù) ( MPN) 值。

1．3．2 固定酶底物法

參照《水質(zhì) 耐熱大腸菌群的測(cè)定 酶底物法》 ( DBJ440100 /T 276—2016) 。 ( 1) 用 100 mL 無(wú)菌稀釋瓶取 100 mL 水樣，加 入( 2. 7±0. 5) g MMO-MUG 培養(yǎng)基粉末，混搖均勻， 使之完全溶解，將水樣全部倒入 97 孔無(wú)菌定量盤 內(nèi)，以手撫平定量盤背面以趕除孔穴內(nèi)氣泡，然后用 程控 定 量 封 口 機(jī) 封 口。將 定 量 盤 放 入 ( 44. 5 ± 0. 5) ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后進(jìn)行結(jié)果判讀: 孔內(nèi)水 樣變成黃色表示該孔內(nèi)含有耐熱大腸菌群。如結(jié)果 為可疑陽(yáng)性，可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間到 28 h，超過(guò) 28 h 后 出現(xiàn)的顏色反應(yīng)，不作為陽(yáng)性結(jié)果。 ( 2) 結(jié)果報(bào)告: 計(jì)算有黃色反應(yīng)的孔穴數(shù)，對(duì)照 97 孔定量盤法不同陽(yáng)性結(jié)果的 MPN 檢索表，查出 其代表的耐熱大腸菌群最可能數(shù)( MPN) 。結(jié)果以 MPN/( 100 mL) 表示，如所有孔未產(chǎn)生黃色，則可報(bào)告耐熱大腸菌群未檢出。

1．4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所得數(shù)據(jù)使用 SPSS 22 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。

2 結(jié)果與分析

固定酶底物法、多管發(fā)酵法 3 次測(cè)定質(zhì)控樣品的平 均 值 分 別 為 147. 5 MPN/( 100 mL ) 和 170 MPN/( 100 mL) ，相 對(duì) 平 均 偏 差 分 別 為 8. 3% 和 9. 85%，精密度良好。兩種方法檢測(cè)結(jié)果均在質(zhì)控 樣品置信范圍內(nèi)［48. 0～498 MPN/( 100 mL) ］，接近 質(zhì)控樣品標(biāo)準(zhǔn)值［180 MPN/( 100 mL) ］，檢測(cè)結(jié)果 可信度良好( 表 1) 。

水體中顆粒物可為微生物生長(zhǎng)提供附著場(chǎng)所， 并通過(guò)包裹作用抵御紫外線的影響，因此，耐熱大腸 菌群數(shù)量隨著濁度升高而增大。依據(jù)監(jiān)測(cè)站 常規(guī)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，選取低濁度( ≤3 NTU) 水樣 32 份， 分別用固定酶底物法和多管發(fā)酵法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果 如圖 1 所示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示: 相 關(guān)系數(shù) r = 0. 824，P = 0. 000，表明兩種方法檢測(cè)結(jié)果 相關(guān)性趨于一致。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本 t 檢驗(yàn)，t = 0. 964，P = 0. 343，表明兩種方法檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異，可認(rèn)為固定酶底物法與多管發(fā)酵法對(duì) 低濁度水樣的檢測(cè)效果一致。選取渾濁( ＞3 NTU) 水樣 19 份，分別用固定酶 底物法和多管發(fā)酵法進(jìn)行檢測(cè)， 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示: 相關(guān)系數(shù) r = 0. 839，P = 0. 000，表明兩種方法結(jié)果的相關(guān)性趨于 一致。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣本 t 檢驗(yàn)，t = 1. 539，P = 0. 141，表明兩種方法檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異( 表 3) ，可認(rèn)為固定酶底物法與多管發(fā)酵法對(duì)渾濁水樣 的檢測(cè)效果一致。

3 討論

目前，在地表水耐熱大腸菌群檢測(cè)工作中大多 數(shù)采用多管發(fā)酵法，檢測(cè)過(guò)程存在諸多問(wèn)題。
( 1) 步驟相對(duì)繁瑣復(fù)雜: 需要一系列前期準(zhǔn)備 工作，配制培養(yǎng)基時(shí)試劑稱量的準(zhǔn)確性、pH 的范圍、 高壓消毒及培養(yǎng)基使用溫度等諸多因素均會(huì)對(duì)最終 結(jié)果造成影響。
( 2) 檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng): 在初發(fā)酵有檢出時(shí)還需經(jīng)過(guò) 復(fù)發(fā)酵和伊紅美藍(lán)瓊脂平板驗(yàn)證兩個(gè)過(guò)程才能得出 耐熱大腸菌群 MPN 值，培養(yǎng)時(shí)間至少需要 72 h，不 能對(duì)水體的衛(wèi)生學(xué)狀況作出快速評(píng)價(jià)。
( 3) 準(zhǔn)確度: 多管發(fā)酵法操作重復(fù)接菌過(guò)程中，程序越多，引入的誤差可能性越大，造成污染的幾率 也較大，結(jié)果的可靠性也就越低。
( 4) 技術(shù)操作: 多管發(fā)酵法每一樣品的發(fā)酵 管數(shù)、接種量有嚴(yán)格要求，需要對(duì)樣品進(jìn)行稀釋， 稀釋過(guò)程中的搖勻是測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度的重要因 素之一，不同人員操作誤差較大，必要時(shí)還要對(duì) 可疑管進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，需要試驗(yàn)人員具備專業(yè)的 微生物知識(shí)，對(duì)試驗(yàn)環(huán)境的無(wú)菌程 度 要 求 也 比 較高。
( 5) 物料成本: 所用試劑綜合成本為 10. 28 元/ 樣品，但需考慮增加的人工成本和配備蒸汽滅菌器 及建設(shè)無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室的成本。