蛋白酶在科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)等方面應(yīng)用廣 泛（唐兵等，2000），其主要產(chǎn)自微生物，但在高溫、 強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、多金屬離子等條件下酶的催化活性并 不好，常有失活情況發(fā)生（林影等，2000）。 高溫蛋 白酶的應(yīng)用前景十分廣闊（廉立慧等，2011），但國 內(nèi)對高溫蛋白酶產(chǎn)生菌的研究相對較晚， 對高溫 蛋白酶催化活性方面的研究還鮮有報(bào)道。

1 材料和方法 

1.1 試驗(yàn)材料 

1.1.1 土壤樣品 

土壤樣品來自大理彌渡縣白總 旗熱泉的底泥，熱泉水溫 55 ℃。 

1.1.2 主要儀器 

顯微鏡（奧林巴斯）；紫外可見 光分光光度計(jì)（上海菁華儀器公司）；高速冷凍離 心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海 一恒科學(xué)儀器有限公司）；水浴恒溫?fù)u床（常州國 華電器有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈 化設(shè)備有限公司）；PCR 擴(kuò)增儀（美國 ABI）；電泳 儀（北京六一生物科技有限公司）。 

1.1.3 試劑 

酵母抽提物、蛋白胨為英國進(jìn)口；瓊 脂粉為西班牙進(jìn)口分裝；脫脂奶粉、三氯乙酸、folin 試劑、濃鹽酸、干酪素、氯化鈉、結(jié)晶紫、碘、乙醇、 孔雀綠、番紅等均為國產(chǎn)分析純試劑。DNA 抽提試 劑盒、PCR 擴(kuò)增試劑盒、 膠回收試劑盒和 DNA 分 子量標(biāo)準(zhǔn)品均購自北京天根生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 

脫脂奶粉培養(yǎng)基：脫脂奶粉 50 g， 水 500 mL，瓊脂粉 10 g，100 ℃滅菌 20 min。 LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，酵母浸出物 5 g，NaCl 10 g， 超純 水 1000 mL， 調(diào) pH 至7.2， 121 ℃滅菌 20 min。 發(fā)酵產(chǎn)酶培 養(yǎng)基：豆粕 20 g，葡萄糖 1 g，蒸 餾水 200 mL，121 ℃滅菌 20 min。 

1.2 試驗(yàn)方法 

1.2.1 菌株富集 

稱取白總旗熱泉底泥 2 g 于 45 mL 的無菌蒸餾水中，150 r/min，振蕩 15 min。在無 菌條件下， 用移液槍吸取 5 mL 懸液于 50 mL 的 富集培養(yǎng)基中，將接種好的富集培養(yǎng)基置于 55 ℃， 轉(zhuǎn)速為 150 r/min 的水浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩 培養(yǎng) 24 h。 

1.2.2 菌株初篩 

將富集好的菌液稀釋至 10-3 、 10-6 、10-9 倍， 用移液槍分別吸取稀釋的菌液 150 μL 接種在篩選培養(yǎng)基平板上，涂布均勻。 于 37 ℃倒 置培養(yǎng) 24 h。 觀察菌落周圍若有水解圈出現(xiàn)，說 明該菌株能產(chǎn)生蛋白酶。 

1.2.3 菌株復(fù)篩 

將初篩得到的菌株取少量接種 于種子瓶（LB 液體培養(yǎng)基），55 ℃培養(yǎng) 24 h 后，將 種子液按 2%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，55 ℃、 150 r/min 水浴搖床培養(yǎng)一周。 離心取上清測酶活。

2 結(jié)果與分析 

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選 

根據(jù)水解圈直徑與菌落 直徑比值的大小。篩選到 3 株產(chǎn)高溫蛋白酶菌株。 其中 1 號菌株 水解圈直徑 與 菌 落 直 徑 比 值（R1/ R2）最大。 經(jīng)復(fù)篩發(fā)現(xiàn) 3 株菌均為分泌型蛋白酶 產(chǎn)生菌，且 1 號菌株酶活最高，為 49.99 U/mL，與 初篩的結(jié)果相符。因此，選擇 1 號菌株作為后續(xù)試 驗(yàn)研究菌株，命名為 Pro-55。 

2.2 菌種鑒定 

2.2.1 形態(tài)學(xué)、 生理生化特征 

Pro-55 在 LB 培 養(yǎng)基上 37 ℃培養(yǎng) 72 h 后， 菌落形態(tài)呈圓形，黃 色，不透明，黏稠，光滑，表面濕潤，中間隆起，邊緣 整齊， 菌落整體較小未產(chǎn)菌絲。 革蘭氏染色呈陽 性，端生芽孢，鞭毛染色后未觀察到鞭毛。 對 Pro-55 的生 理 生 化 特 性 進(jìn) 行 研 究 發(fā) 現(xiàn)， V-P 試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果均為弱 陽性。明膠試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、葡萄糖 發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。 

2.2.2 16S rRNA 基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析 

16S rRNA 基因測序， 所獲得的序列長度為 1438 bp， 將 Pro-55 的 16S rRNA 基因 序 列 與 GenBank 數(shù) 據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn) Pro-55 與短 芽 孢 桿 菌 屬 的 16S rRNA 基 因 序 列 自 然 聚 類 ， Pro-55 的 16S rRNA 基因序列與 16 條相似性較 高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖 1， 從圖中可以看 出 Pro -55 與 Brevibacillus sp. FJAT -21992 （KP728965.1）菌株聚為一群，相似性也最高，表明 Pro-55 與 Brevibacillus sp.的菌株親緣關(guān)系最近。 根據(jù) Pro-55 的形態(tài)及生理生化特征， 結(jié)合 《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第八版）（布坎南，1984）， 以及 Pro-55 16S rRNA 基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹， 將 Pro-55 初步鑒定為短芽 孢桿菌屬（Brevibacillus sp.） 的一 株 菌， 命 名 為 Brevibacillus sp.Pro

2.3 菌種的最適生長溫度 

按照試驗(yàn)方法，在波 長 600 nm 處測定不同溫度培養(yǎng)下 LB 培養(yǎng)基的 吸光值，以 600 nm 處的吸光值為縱坐標(biāo)，溫度為 橫坐標(biāo)作溫度—吸光值關(guān)系曲線，結(jié)果如圖 2。

從圖 2 可知，25 ～ 43 ℃菌株的生長量隨著溫 度 的 升 高 而 增 加，43 ℃時，LB 培養(yǎng) 基 在 600 nm 下的吸光值最高，表明 43 ℃是菌株的最適生長溫 度。 45 ℃以后，菌株生長量隨著溫度的升高而下 降，菌株在 55 ℃下仍能生長，表明菌株屬于典型 的耐高溫菌。

3 結(jié)論 

高溫蛋白酶是一類廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日 用化工等方面且有著巨大開發(fā)潛力的酶， 在微生 物體內(nèi)廣泛 存在 （徐輝 艷 等，2009； 胡青 平 等， 2005）。 本次試驗(yàn)得到的菌株經(jīng)分子鑒定為短芽 孢桿菌；其最適生長溫度為 43 ℃，酶反應(yīng)最適溫 度 40 ℃，酶反應(yīng)最適 pH 為 6.0，在最適反應(yīng)溫度 下酶活力為 36.74 μg/mL； 在 37 ℃以下酶具有較 好的熱穩(wěn)定性。 Ca2+ 、Zn+ 、Mg2+ 、Cu2+ 等離子對酶液 的酶活性均有促進(jìn)作用， 同時酶液具有很強(qiáng)的離 子耐受力。本文所篩選菌株在 55 ℃高溫下依然具 有較強(qiáng)的酶活力，且溫度耐受性較強(qiáng)。 

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